Please use this identifier to cite or link to this item: http://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19551
Full metadata record
DC FieldValueLanguage
dc.contributor.advisorNunta Churngchow-
dc.contributor.authorSittiporn Pettongkhao-
dc.date.accessioned2024-07-09T08:51:34Z-
dc.date.available2024-07-09T08:51:34Z-
dc.date.issued2019-
dc.identifier.urihttp://kb.psu.ac.th/psukb/handle/2016/19551-
dc.descriptionDoctor of Philosophy (Biochemistry), 2019en_US
dc.description.abstractPhytophthora palmivora is a destructive oomycete plant pathogen with a wide host range. So far, little is known about the factors governing its infection structure development and pathogenicity. From the culture filtrate of P. palmivora, I identified a secreted glycoprotein of 15 kDa, designated as Ppal15kDa, using liquid chromatography tandem mass spectrometry (LC-MS/MS). Two variants, Ppal15kDaA and Ppal15kDaB were amplified from a P. palmivora papaya isolate. Transient expression of both variants in Nicotiana benthamiana by agroinfiltration enhanced P. palmivora infection. Six Ppal15kDa mutants with diverse mutations were generated via CRISPR/Cas9-mediated gene editing. All mutants were compromised in infectivity on N. benthamiana and papaya. Two of the mutants which all Ppal15kDa copies were mutated lost almost complete pathogenicity. The pathogenicity of the other four containing at least one wild-type copy of Ppal15kDa was compromised at varying levels. The mutants were also affected in development as they produced smaller sporangia, shorter germ tubes, and less appressoria. Interestingly, the affected levels in development corresponded to the levels of reduction in pathogenicity, suggesting that Ppal15kDa plays an important role in normal development of P. palmivora infection structures, which contributes to successful infection. Consistent with its role in infection structure development and pathogenicity, Ppal15kDa was found to be highly induced during appressorium formation. In addition, Ppal15kDa homologs are broadly present in Phytophthora spp, but none were characterized. Altogether, this study identified a novel component involved in development and pathogenicity of P. palmivora and possibly many other Phytophthora spp. Elicitors play an important role in plant and pathogen interactions. The discovery of new elicitors and their effects on plant defense responses is significant and challenging. In this study, I investigated novel elicitors from P. palmivora and their effects on plant defenses. A crude elicitor isolated by ethanol precipitation from culture filtrates of P. palmivora induced cell death in tobacco leaves. When tobacco leaves were infiltrated with this cell death-inducing elicitor, the accumulations of H2O2, salicylic acid (SA), scopoletin (Scp) and abscisic acid (ABA) were detected. Accumulations of SA, Scp and ABA were also induced in rubber tree leaves. P. palmivora infection significantly increased in rubber tree leaves pretreated with the elicitor and co-treated with the elicitor and zoospores of P. palmivora. This elicitor can be described as compound elicitor because Fourier-transform infrared (FTIR) spectroscopy revealed that it consisted of both polysaccharides and proteins. I also found that the cell death effect caused by this compound elicitor was completely neutralized by Proteinase K. The compound elicitor was composed of four fractions which were beta-glucan (F1), high-molecular-weight glycoprotein (F2), broad- molecular-weight glycoprotein (F3) and 42 kDa protein (F4). Interestingly, the broad- molecular-weight glycoprotein (F3) caused the highest level of cell death in tobacco leaves, while the beta-glucan (F1) had no effect. The high-molecular-weight glycoprotein (F2), broad-molecular-weight glycoprotein (F3) and 42 kDa protein (F4) fractions not only caused cell death in tobacco leaves but also induced high levels of SA accumulation. Furthermore, these three fractions clearly promoted P. palmivora infection of rubber tree leaves. P. palmivora is a hemibiotrophic pathogen. It can survive in dead tissue. This study revealed that P. palmivora could use cell death- inducing elicitors to promote its infection. Elicitors from seaweeds are considered as alternative stimulants of plant defenses against pathogenic infection. Finding new sources of elicitors and exploring their effects on plant defenses is a significant undertaking. In this study, I extracted crude polysaccharide (CPS) from Acanthophora spicifera (a red alga) and tested the effects of the compound on rubber tree (Hevea brasiliensis) defense responses. Accumulations of SA and Sep were measured by HPLC. The expressions of SA- and Jasmonic acid (JA)-responsive genes were analyzed by semi-qRT-PCR. Strong anion exchange chromatography and FTIR spectroscopy were used for purification and functional characterization of CPS, respectively. The extracted CPS enhanced rubber tree defenses against P. palmivora infection. It induced SA and Scp accumulations and SA-responsive gene expression, but suppressed JA-responsive gene expression. I successfully separated the non-sulphated polysaccharide (F1) from the sulphated polysaccharides (SPS). Both peaks of SPS (F2 and F3) were identified as lambda (2)-carrageenan. The F3 fraction showed greater elicitor activity on tobacco leaves. It induced SA and Sep accumulations and peroxidase activity but suppressed catalase activity. Furthermore, the purified 2-carrageenan did not cause cell death in tobacco or rubber tree leaves. Therefore, the elicitor from A. spicifera could be an alternative plant stimulant.en_US
dc.description.sponsorship1.The Excellent Scholarships in Biochemistry, Department of Biochemistry, Faculty of Science, Prince of Songkla University, Thailand 2. The Graduate School of Prince of Songkla University, Thailand 3. The Royal Golden Jubilee Graduated Program (RGJ-PHD) through the Thailand Research Fund (TRF) to Mr. Sittiporn Pettongkhao (PHD/0067/2556)en_US
dc.language.isoenen_US
dc.publisherPrince of Songkla Universityen_US
dc.rightsAttribution-NonCommercial-NoDerivs 3.0 Thailand*
dc.rights.urihttp://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/3.0/th/*
dc.subjectGlycoproteinsen_US
dc.titleNovel Factors from Phytophthora palmivora Promote Its Infection and a Potential Elicitor from Acanthophora spicifera Enhances Hevea brasiliensis Resistanceen_US
dc.title.alternativeแฟกเตอร์จากเชื้อ Phytophthora palmivora ที่สามารถส่งเสริมตัวเองในการก่อโรค และอิลิซิเตอร์จากสาหร่ายหนามมงกุฎ (Acanthophora spicifera) ที่มีศักยภาพในการเพิ่มความต้านทานโรคให้กับยางพาราen_US
dc.typeThesisen_US
dc.contributor.departmentFaculty of Science (Biochemistry)-
dc.contributor.departmentคณะวิทยาศาสตร์ ภาควิชาชีวเคมี-
dc.description.abstract-thPhytophthora palmivora เป็นโอโอไมซิส (Oomycete) ที่สามารถทําลายพืชได้หลายชนิด จนถึงขณะนี้ความรู้ที่เกี่ยวข้องกับปัจจัยในการพัฒนาโครงสร้างของเชื้อ เพื่อทําให้เกิด โรคยังมีน้อยมาก ในการศึกษาครั้งนี้ ผู้วิจัยได้แยกไกลโคโปรตีน 15 kDa จากน้ําเลี้ยงเชื้อ P. palmivora และระบุชนิดของโปรตีนด้วยวิธี Liquid Chromatography-Tandem Mass Spectrometry (LC-MS/MS) หลังจากนั้นได้ทําการแยกยืนที่สร้างไกลโคโปรตีน 15 kDa พบมี 2 variants คือ Ppal15kDad และ Ppal15kDaB แล้วพบว่าต้นยาสูบที่ได้ฝากถ่ายยืนดังกล่าวด้วย Agrobacterium มี การติดเชื้อ P. palmivora เพิ่มขึ้น ผู้วิจัยใช้เทคนิค CRISPR/Cas9 เพื่อทําให้เกิดการกลายพันธุ์ของยีน Ppal15kDa โดยสามารถสร้าง มิวแทนท์ได้ 6 ไลน์ (line) ที่มีความสามารถในการเกิดโรคลดลงทั้ง ในใบยาสูบและผลมะละกอ โดยพบว่ามีมิวแทนท์ 2 ไลน์ที่ยืน 15 kDa กลายพันธุ์ทุก copy ได้ สูญเสียความสามารถในการก่อโรคเกือบสิ้นเชิง ส่วนมิวแทนท์อีก 4 ไลน์ ที่ยังมียีน wild-type 15 kDa อยู่ มีความสามารถในการก่อโรคที่ลดลงแตกต่างกันไป มิวเทชั่นของยีน 15 kDa ก่อให้เกิด ความบกพร่องในการพัฒนาการของเชื้อ ได้แก่ สร้าง sporangium ที่มีขนาดเล็กลง สร้าง germ tube ที่สั้นลง รวมถึงมีความสามารถในการสร้าง appressorium ที่ลดลง ผู้วิจัยยังพบอีกว่ายีน Ppall5kDa มีการแสดงออกที่สูงในขณะที่เชื้อกําลังสร้าง appressorium ซึ่งสอดคล้องกับการทดลองข้างต้น ยืน นี้พบได้ใน Phytophthora spp. หลายชนิด แต่ยังไม่ทราบการทํางานของยีนดังกล่าว งานวิจัยชิ้นนี้ได้ แสดงให้เห็นว่า ยีน Ppal15kDa มีบทบาทสําคัญต่อพัฒนาการของเชื้อซึ่งส่งผลต่อการก่อโรคในพืชอิลิซิเตอร์มีบทบาทสําคัญในปฏิสัมพันธ์ระหว่างพืชกับเชื้อโรค การค้นพบ อิลิซิเตอร์ชนิดใหม่ รวมถึงการศึกษาผลกระทบต่อระบบภูมิคุ้มกันของพืชมีความสําคัญมาก ผู้วิจัย ได้ศึกษาอิลิซิเตอร์อื่นๆ จากเชื้อ P. palmivora หลังจากนําน้ําเลี้ยงเชื้อไปทําให้ตกตะกอนด้วยเอทา นอล พบว่าอิลิซิเตอร์สกัดหยาบที่ได้สามารถกระตุ้นให้เกิดการตายของเซลล์ในใบยาสูบ และทําให้เกิดการสะสมของไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ อิลิซิเตอร์ดังกล่าวกระตุ้นให้เกิดการสะสมของกรดซาลิไซลิก (SA) สคอพอเลติน (Scp) และ กรดแอบไซซิก (ABA) ในใบยาสูบและในใบยางพารา และ ยังส่งเสริมให้ใบยางพาราติดเชื้อเพิ่มขึ้น จากการใช้เทคนิค Fourier Transform Infrared Spectrometer (FTIR) บ่งบอกว่าอิลิซิเตอร์สกัดหยาบดังกล่าวประกอบด้วยส่วนที่เป็นคาร์โบไฮเดรต และส่วนที่เป็นโปรตีน พบว่าเอนไซม์ Proteinase K สามารถทําลายความสามารถในการกระตุ้นการ ตายของเซลล์ ผู้วิจัยสามารถแยกอิลิซิเตอร์จากสารสกัดหยาบ ได้ 4 ส่วน คือ เบต้ากลูแคน (F1) ไกล โคโปรตีนขนาดใหญ่ (F2) ไกลโคโปรตีนที่มีหลายขนาด (F3) และ โปรตีน 42 Da (F4) ส่วนที่ สามารถทําให้เกิดการตายของเซลล์ คือ F2, F3 และ F4 เป็นที่น่าสนใจว่าส่วนที่ทําให้เกิดการตาย ของเซลล์สามารถกระตุ้นให้เกิดการสะสมของกรดซาลิไซลิกที่สูง และสามารถเหนี่ยวนําให้เกิดการ ติดเชื้อ P. palmivora ได้มากยิ่งขึ้น P. palmivora เป็น hemibiotroph คือสิ่งมีชีวิตที่ช่วงแรกๆ อาศัย ในเซลล์ที่มีชีวิตและภายหลังสามารถเจริญเติบโตในเซลล์ที่ตายได้ งานวิจัยชิ้นนี้แสดงให้เห็นว่าเชื้อ P. palmivora ใช้ประโยชน์ จากอิลิซิเตอร์ที่ก่อให้เกิดการตายของเซลล์ส่งเสริมตัวเองในการก่อโรค สุดท้ายผู้วิจัยได้ศึกษาอิลิซิเตอร์ที่แยกได้จากสาหร่ายทะเลหนามมงกุฎ (Acanthophora spicifera) ซึ่งปัจจุบันสาหร่ายทะเลกลายเป็นแหล่งทางเลือกของอิลิซิเตอร์ที่ใช้เพื่อ กระตุ้นความต้านทานโรคในพืช งานวิจัยชิ้นนี้ได้นําสารสกัดหยาบโพลีแซคคาไรด์จากสาหร่ายหนามมงกุฎมาใช้เพื่อกระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันในยางพารา วิเคราะห์การสะสมของกรดซาลิไซลิก และ สคอพอเลติน ด้วยเทคเน็ค High Performance Liquid Chromatography (HPLC) และศึกษาการ แสดงออกของยีนในระบบ กรดซาลิไซลิกและกรดจัสโมนิก ด้วยวิธี semi-qRT-PCR พบว่า ยางพาราที่ผ่านการฉีดพ่นด้วยโพลีแซคคาไรด์สกัดหยาบสามารถลดการติดเชื้อ P. palmivora ได้ สารดังกล่าวเหนี่ยวนําให้เกิดการสะสมของ กรดซาลิไซลิก และ สคอพอเลติน ทั้งยังกระตุ้นการ แสดงออกของยีนในระบบกรดซาลิไซลิก ตรงกันข้าม สารสกัดที่ได้ยับยั้งการแสดงออกของยีนใน ระบบ กรดจัสโมนิก หลังจากทําบริสุทธิ์สารสกัดหยาบโพลีแซคคาไรด์ พบว่าประกอบด้วย โพลี แซคคาไรด์ที่ไป ไม่มีหมู่ซัลเฟต (F1) และมีหมู่ซัลเฟต (F2 และ F3) โดยชนิดที่ไม่มีหมู่ซัลเฟต ไม่ สามารถกระตุ้นให้ยางพาราสร้างสคอพอเลติน สําหรับชนิดที่มีหมู่ซัลเฟตนั้น พบว่าเป็นคาราจีแนน ชนิดแลมด้า และพบว่า แลมด้าคาราจีแนนที่มีประจุลบมากกว่าสามารถกระตุ้นการสร้างสคอพอ เลตินได้ดีกว่า นอกจากนี้แลมด้าคาราจีแนนยังยับยั้งกิจกรรมของเอนไซม์ คาตาเลส แต่กระตุ้น กิจกรรมของเอนไซม์เปอร์ออกซิเดส สุดท้ายผู้วิจัยพบว่าแลมด้าคาราจีแนน เป็นมิตรต่อพืช คือไม่ ก่อให้เกิดการตายของเซลล์พืช ดังนั้นสารสกัดดังกล่าวสามารถใช้เป็นอิลิซิเตอร์ทางเลือกในการ กระตุ้นระบบภูมิคุ้มกันในยางพาราได้en_US
Appears in Collections:328 Thesis

Files in This Item:
File Description SizeFormat 
436795.pdf5.66 MBAdobe PDFView/Open


This item is licensed under a Creative Commons License Creative Commons